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文獻解讀 | iPS細胞來源的肺泡干細胞在類器官中的研究
科技服務 2017-03-02


文章來源:

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背景知識


在肺中,AT2(Alveolar epithelial type II)細胞能夠產生肺表面活性劑,起到組織干細胞的功能,有助于肺泡的穩態。AT2細胞功能如果出現障礙,則會產生危及生命的肺部相關疾病,包括慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化和肺癌等。盡管對這些疾病的機制和發現新藥物的研究有很高的需求,但目前并沒有很好的研究模型。

hiPSCs是AT2細胞的潛在來源。雖然已經報道了從多能干細胞(PSCs)逐步誘導AT2細胞的逐步誘導,但在維持AT2穩定擴增的步驟并沒用得到很好的解決。在本研究中,作者對夠從iPS進行高效誘導獲得肺泡干細胞的方法進行了優化,并構了建能夠長期擴增的肺泡類器官(alveolar organoids,AOs),為研究藥物誘導的肺泡損傷在體外提供了一個新的藥物毒理學平臺。

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解讀專欄

01 技術路線:從iPS細胞誘導成為SFTPC+細胞

前期已有文獻報道,可進行從VAFE細胞(靜脈前前腸內胚層)分化為AT2細胞,但分化效率十分低下。同時,先前的實驗表明,在肺發育后期的遠端細胞(distal tip)只分化為AT。因此作者提出假說,可對NKX2-1+的 VAFE細胞進行預處理,模擬遠端細胞的微環境,從而提高AT2細胞分化的效率。在利用了各種生長因子和與肺發育有關的小分子進行嘗試后,CHIR99021+FGF10+KGF+DAPT四因子組合能夠很好地提高分化的效率。


02 分子層面驗證分化狀態:對進行預處理的祖細胞進行單細胞測序

為了更好地了解VAFE細胞的預處理情況,作者在CFKD處理前后分離CPM +祖細胞,一共對71例處理前、85例處理后的CMP+祖細胞和50例SFTPC+細胞進行了單細胞rna - seq及分析。結果表明,在大多數細胞中都表達了Progenitor標志物(CPM,nkx2 - 1和FOXA2),而AT2標記很少在CPMhi祖細胞中表達。對所有差異基因進行主成分分析(PCA)顯示,CFKD處理后的CPMhi細胞(21天)聚集在了CPMhi細胞(第14天)和SFTPC + cells(第26天)之間,這表明CFKD對CPMhi細胞的預處理有利于向SFTPC +細胞分化。并且在SFTPC+差異表達的細胞中,發現了Wnt, MAPK and Hippo p等已報道與肺泡分化或肺分支形態發生相關通路和

ETV5and CEBPD等已知與AT2發育相關基因。從分子水平上表明了iPS細胞成功誘導成為了 SFTPC+細胞,并且與AT2細胞相似。


03 從iPS誘導獲得的FD-SFTPC+細胞可在體外長期擴增

      同時,作者對獲得的SFTPC+細胞長期擴增能力進行了驗證。結果表明,細胞可以在體外進行不斷培養,截至文章發表時已經傳代培養超過了200d。并且,在相關標記物的鑒定和形態學鑒定上,后代的細胞仍然穩定保留了初期細胞的特點。



04 不依賴成纖維細胞(fibroblast-free,FF)的SFTPC+cells分化探索

作者還嘗試了不依賴成纖維細胞,進行SFTPC+細胞分化的探索實驗。通過加入不同小分子刺激,作者發現,同時加入CHIR99021(Wnt通路受體激動劑)和SB431542(TGF-β受體激酶的抑制劑)能夠有效地將CPMhi progenitor細胞分化為SFTPC +細胞。


雖然FF-SFTPC+,FD-SFTPC+細胞都與AT2有著一致的表達模式,但在某些特定的標記物上還是有區別,提示不同的誘導方式還是對細胞的狀態產生了一定的差異。



05 肺泡類器官作為毒理學模型,進行相關藥物毒性評價

     Amiodarone胺碘酮是一種廣泛使用的抗心律失常藥物,因引起藥物間質性肺炎而臭名昭著。

     GNE7915是LRRK2的小分子抑制劑,是家族性帕金森病的致病基因表達的激酶。作者利用構建的肺泡類器官,在分化4d的時候加入了相關藥物分子,并在14d收集細胞,進行形態學及分子層面的分析。

結果表明,在藥物處理后的AOS上的層狀體顯著地增大和增加,很好的模擬了體內AT2細胞對藥物產生的特異性。而轉錄組分析結果發現Amiodarone特異的差異基因中富集了與傷口愈合,細胞因子分泌和IL- 6產生等相關的基因;而GNE7915特異的差異基因則與發育相關。

胺碘酮和GNE7915之間的這些差異可能部分解釋了在體內胺碘酮引起肺損傷中更為嚴重的表型。表明作者構建的AOS能夠作為一個毒理學模型,進行藥物毒性的研究。


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研究結論及意義

?  建立了從hiPSCs分化為肺泡干細胞的高效方案:在前體細胞進行一步預處理。SFTPC +細胞的分化效率在所有被分析的細胞系中都有了顯著改善。

?  首次報告了SFTPC +肺泡干細胞長期培養的方法,獲得的肺泡類器官可適用于藥物毒理學測試。

以上就是文章《long-termexpansion of alveolar stem cells derivedfromhuman iPS cells in organoids》的全部內容啦,若有疑問歡迎隨時咨詢!我們下期文獻詳解再見!





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